激光扫描共聚焦显微镜的功能[激光扫描共聚焦显微镜使用说明]

1.激光共聚焦DIC通道的光源是什么？

DIC通道的光源是激光，用的是透射光检测装置，只有透光的样品才可看到。

2.荧光和白光是反射光还是透射光？

用汞灯和激光激发发射的荧光都是反射光，卤素灯照明看到的光是透射光，不透明物体，卤素灯看不到。

3.共聚焦荧光通道的颜色是实际颜色吗？

不是，是伪彩色，光电倍增管只检测强度信息，不检测颜色信息。颜色可以随意更改。不过可通过发射波长的范围，判断大概为什么颜色。

4.彩色CCD看到的是实际颜色吗？

是实际颜色，用RGB进行了还原，但CCD颜色与目镜中看到的稍有差异。

5.激光激发肯定比汞灯激发荧光强吗？

不一定，首先激光是单色光，如488nm，而汞灯下，有一定宽度的波长范围，如470-495nm， 激发波长不一样，得到图片的效果不一样；其次，激光下采集荧光用共聚焦模式，样品层切得比较薄，而汞灯下用CCD采集图片，样品层切得比较厚。因此看弱荧光，经常是激光不如汞灯下看得更好。

6.共聚焦拍照与普通荧光显微镜拍照有什么不同？

共聚焦用激光做光源，光电倍增管做检测器，逐点扫描，对应每个像素其能量比较高；汞灯虽然总功率高，但属于场照明，对应每个像素的能量并没有激光高。共聚焦有针孔，可以排除焦平面

上焦点以外及非焦平面杂散光的影响，因此空间分辨率提高，但因为是每个像素每个像素逐点扫描，采集较慢，一张图并不是同一时间采集的，时间分辨率不高；CCD拍照取的是样品的同一时

间。

7.显微镜最重要的部件是什么？

是物镜，物镜数值孔径（N.A.）越大，其分辨率越高。普通光镜△R（分辨率）= 0.61λ/ N.A.；共聚焦△R = 0.51λ/ N.A.，λ为激发光波长。相同倍数的物镜，其N.A.值越大，荧光透过的

越多，与N.A.平方成正比；N.A.值越大，焦深越小，也就是看到的样品层越薄。

8.放大倍率怎么计算？

如果从目镜观察，观察倍率(M) = 物镜倍率 X 目镜倍率显示器观察, 视频系统（M）= (显示器对角线/CCD对角线) X 接口倍率 X 物镜倍率，共聚焦图片的放大倍率，与像素分辨率、每个像素的大小、及图像的实际大小相关。 M = 图像的实际大小/ (像素分辨率X每个像素的大小)

9. 为什么油镜比干镜分辨率高？

倒置的荧光显微镜，对干镜，激光透过物镜进入盖玻片，在物镜和盖玻片之间会有空气，激光从物镜进入空气，也就是从光密介质进入光疏介质，光会偏离法线，造成损失；对于油镜，浸油的折射率与玻璃一样，因此激光从物镜进入浸油没有光损失，因此用油镜分辨率要高。

一、观察及仪器操作
 
1.  开启仪器电源及光源

一般先开启显微镜和激光器，再启动计算机，然后启动操作软件，设置荧光样品的激发光波长，选择相应的滤光镜组块。以便光电倍增管(photo multiplier tube，PMT)检测器能得到足够的信号结果。使用汞灯的注意事项同普通荧光显微镜。
 
2.  设置相应的扫描方式
在目视模式下．调整所用物镜放大倍数，在荧光显微镜下找到需要检测的细胞。切换到扫描模式，调整双孔针和激光强度参数，即可得到清晰的共聚焦图像。
 
3.  获取图像
选择合适的图像分辨率，将样品完整扫描后，保存图像结果即可。
 
4.  关闭仪器
仪器测定样品结束后，先关闭激光器部分，计算机仍可继续进行图像和数据处理。若要退出整个激光扫描共聚焦显微镜系统．则应该在激光器关闭后，待其冷却至少10分钟后再关闭计算机及总开关。
 
二、获取三维图像 

激光扫描共聚焦显微镜具有细胞“CT”功能，因此，它可以在不损伤细胞的情况下，获得一系列光学切片图像。选用“Z-Stack"模式，即可实现此项功能。
 
1.  开启“Z-Stack”选项。
 
2.  确定光学切片的位置及层数。
 
3.  启动“Start”，获得三维图像。
 
三、获取时间序列图像 

共聚焦显微镜的"Time-Series"功能，可以自动在实验者规定的时间内按照设定的时间间隔获取图像。只需设定所需的时间间隔以及所需图像数量，开启“Start T”功能键，即可进行实验。“Time-Series"功能大大减轻了实验者的劳动强度，对于荧光漂白恢复和钙离子成像等实验非常实用。